支气管扩张症合并铜绿假单胞菌感染免疫机制研究进展
支气管扩张症合并铜绿假单胞菌感染免疫机制研究进展
支气管扩张症已经成为国内外常见呼吸系统疾病，铜绿假单胞菌感染是支气管扩张症常见的细菌感染，致病性强，且易耐药。支气管扩张症患者容易反复感染，与病原体、宿主体内微生物群以及免疫调节等方面的相互作用有关，淋巴细胞及各种炎症细胞释放的细胞因子在支气管扩张症的免疫机制中起到重要的调节作用；当支气管扩张症合并铜绿假单胞菌感染时，引起Th17/Treg、Th1/Th17失调以及IL-17a水平升高等，进一步加重支气管扩张症患者的免疫功能紊乱。本文综述二者的免疫机制，为支气管扩张症预防铜绿假单胞菌感染和进一步的免疫调节治疗提供思路。
支气管扩张症(简称支扩)是气道的不可逆扩张，主要表现为持续或反复气道感染、咳嗽、咳大量脓痰、咯血等。Quint等[1]的研究证实支扩发病率明显上升，支扩实际患病率远超过1.2%[2]，严重危害人类健康，然而我国目前对支扩的重视远低于COPD、哮喘等疾病。支扩合并铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)感染是支扩急性发作的重要原因[3]，支扩通过改变免疫细胞及炎症因子水平等影响机体免疫功能，而PA对机体免疫功能也有影响，目前尚无研究表明二者之间是否存在关联。本文主要阐述支扩的免疫调节、PA特性以及支扩合并PA感染的免疫机制，以探索二者之间的关联，为支扩合并PA感染的治疗提供思路。
1 支扩的免疫调节
1.1 中性粒细胞
支扩急性发作时通过影响免疫细胞以及IL-17a、IL-8等炎症因子水平，进而影响机体免疫水平。研究[4]表明，病原体、宿主体内微生物群以及免疫调节等方面的相互作用导致支扩患者易反复感染。在支扩患者中，中性粒细胞是气道分布最多的细胞，炎症发生时其发挥重要作用，主要机制是通过表面受体识别细菌结构，释放大量蛋白酶，诱导机体释放细胞因子，从而直接促进炎症的进展。Kolbe[5]结合已有文献总结称中性粒细胞在支扩中具有更大的活性，在支扩免疫机制调节中起重要作用。
1.2 淋巴细胞
淋巴细胞是最基础的细胞免疫调节细胞，其中T淋巴细胞在支扩患者清除细菌中具有重要作用。依据表面分化抗原，将T淋巴细胞分为CD4+T细胞(辅助性/诱导性T细胞)、CD8+T细胞(细胞毒性/抑制性T细胞)等多种亚群[6]。临床上通过检测T淋巴细胞亚群分析判断免疫情况，CD4+T细胞的作用是辅助、调节细胞免疫，幼稚的CD4+T细胞可以分化为Th1、Th2、Th17以及调节性T(Treg)细胞等。有研究[7]对比吸烟者的肺及支扩患者的肺，观察到支扩患者肺中的IL-17a免疫染色增加，经过论证得出Th17分泌的IL-17a可以促进肺三级淋巴器官的发育，证实CD4+T细胞在肺部免疫方面的作用。迟妍等[8]结合文献研究指出支扩患者支气管黏膜活检、支气管灌洗液中发现T淋巴细胞增多，主要为CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞，从而表明细胞免疫异常会影响支扩的发生发展。相同的研究探索33例支扩患者提示在反复感染的机体中，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞均较健康组低，同样表明免疫力缺陷是支扩的发病原因之一[9]。
1.3 IL-8
支扩患者机体免疫细胞发挥主要作用的同时炎症因子IL-8也发挥重要作用。汪俊美等[10]研究表明支扩急性发作期IL-8在支气管上皮细胞中过度表达，而Reynolds等[11]通过研究表达人IL-8的转基因小鼠证明IL-8介导中性粒细胞增多，具有增强中性粒细胞成熟、活化和趋化性以及对PA攻击的保护等作用。
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2 PA的特性
2.1 PA的特点
PA是一种兼性厌氧革兰氏阴性杆菌，通常受益于防御机制受损而引起感染且易产生耐药。PA是感染后支扩重要的细菌病原体，周笳等[12]对感染组309例支扩患者病原学的分析结果中，PA占比25.6%。Inchingolo等[13]也提出PA在支扩的细菌感染中占20%~40%。在囊性纤维化支扩中自身免疫抗体通过对杀菌/通透性增加蛋白产生反应对抗PA感染[14,15]，因此在免疫力降低的支扩患者中自身免疫抗体减少更易导致PA感染。
2.2 PA的作用机制
PA导致支扩急性加重的作用机制主要包括[16]：(1)分泌蛋白质及细胞成分，其中脂多糖、藻酸盐等与树突状细胞及巨噬细胞上的NOD样受体彼此相互作用，从而激活宿主体内的炎症及免疫反应；(2)PA上的弹性蛋白酶LasB可降解宿主的信号蛋白，包括细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白等，从而损伤气道结构；(3)PA释放绿脓素，增强巨噬细胞的渗透，激活Th2反应，同时通过诱导细胞死亡、促进细胞因子释放和限制纤毛功能来抑制细胞生长；诱导释放IL-8和白三烯B4，导致持续的中性粒细胞呼吸道反应。PA产生耐药性的主要机制有：(1)PA具有遗传多样性，正是这样的特性，使其在宿主体内可形成生物膜[17]，从土壤、水再到气道甚至呼吸机管路的环境都能很快适应；(2)PA表面还存在多个外排泵，从而固有地对许多抗生素具有抗性；(3)PA可以通过突变或通过水平基因转移获得基因从而产生抗性。
3 支扩合并PA感染的免疫调节
3.1 Th17
Yong等[18]称Th17细胞和Treg细胞作用是新兴研究领域，在慢性PA感染中细胞因子IL-17a显著升高，因此Th17被认为通过促炎细胞因子IL-17a与Th2途径协同募集中性粒细胞和巨噬细胞等发挥作用。慢性PA感染的支扩患者中细胞因子IL-17a的升高可能与病情急性加重有关，说明其可能是测量全身炎症的靶点[19]。当IL-17a经抗体中和消耗后PA感染的症状更加严重，表明Th17在PA感染中发挥重要作用[20]。近年来研究[21]关注Th17反应在呼吸道病原体黏膜免疫反应中的作用。有关小鼠急性肺炎模型的研究已经证实Th17反应减少小鼠肺部细菌数量，使得PA感染小鼠的存活率高于对照组，在对抗PA感染方面表现为保护作用。此外，肺炎克雷伯菌感染的小鼠模型研究发现记忆Th17细胞可以独立于血清特异性抗体而启动黏膜免疫反应，并且Th17免疫反应效果与Th1/Th17平衡机制存在关联。
IL-17a与气道上皮细胞上的IL-17受体结合后，激活核因子κB信号通路，促进中性粒细胞趋化因子的分泌，并刺激气道上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，进一步促进中性粒细胞浸润，引起以中性粒细胞浸润为主的气道炎症[22]。Li等[23]发现一种群体感应信号，即自体诱导剂2，在体外和体内促进野生型PAO1菌株的致病性。研究表明与单独感染PAO1相比，感染PAO1联合自体诱导剂2治疗可显著增加野生型小鼠肺组织中IL-17a水平、Th17细胞数量和STAT3水平，并可引起更严重的肺损伤。此外他们还发现与感染PAO1后的IL-17A水平相比，携带群体感应基因lasR和rhlR突变的PA菌株感染后野生型小鼠肺中的IL-17a水平显著降低。文中数据表明自体诱导剂2通过干扰PA的群体感应系统，通过IL-17a途径促进PAO1急性肺部感染，最终提出IL-17a可能是临床治疗PA急性肺部感染的治疗靶点的这一观点。
3.2 Th17/Treg比值
罹患支扩的患者本身存在免疫功能缺陷，导致PA更易入侵机体，而PA影响T淋巴细胞比例及炎症因子水平对支扩患者机体再次造成免疫损伤。一项以大鼠为模型的实验中[24]，10只SD大鼠注入PA以建立支扩模型组，与单纯支气管切开组(n＝10)及空白对照组(n＝10)进行对比，结果显示模型组的肺功能较其他2组降低，考虑与Th17/Treg失衡有关。同时一项病例对照研究[25]利用胸腺肽α1联合肺泡灌洗疗法研究支扩合并PA感染患者免疫功能机制，结果显示治疗后患者外周血中Treg细胞明显升高，Th17比例及Th17/Treg比值降低，证实Treg细胞影响支扩合并PA感染机体免疫功能的调节。同时Westhölter等[26]的研究表明慢性PA感染会损害囊性纤维化支扩患者的Treg细胞。
3.3 重组疫苗
PA长期定植、易耐药等特性导致支扩患者急性加重风险升高，增加了支扩合并PA感染的治疗难度，因此学者们依据其耐药机制，研制OprD和OprH等PA孔蛋白重组疫苗以探索支扩合并PA感染的治疗方案。外膜通透性下降是PA耐药机制之一[27]，作用机制为：改变抗生素载体孔蛋白OprD2编码基因，降低细胞对碳青霉烯类抗生素的敏感性，造成PA的耐药特性。研究[28]通过克隆、表达、纯化等重组OprD基因，对PA疫苗研制提供理论依据；OprH是PA最小的孔蛋白，其通过诱导脂多糖作用而产生耐药，因此针对OprH重组的疫苗[29]诱导小鼠产生体液及细胞免疫应答，从而提高小鼠抵抗力。
与此同时，针对免疫调控靶点的PA疫苗研究同样受到学者关注。Ⅲ型分泌系统[30]是PA的关键毒力因子，铜绿假单胞菌Ⅴ抗原(PcrⅤ)是Ⅲ型分泌系统的组件蛋白，在分泌和转运毒素过程中发挥"开关"作用。反向疫苗学技术证明PcrⅤ为强烈诱导Th17应答的抗原蛋白[31]，是重要的免疫调控靶点。此外，有学者[32,33]针对PcrⅤ与转位蛋白POPB的融合抗原PAF进行新型亚单位疫苗研究，发现PAF通过黏膜佐剂双突变不耐热肠毒素A1亚基的N端融合实现自我调节，并在小鼠鼻内注射时诱导出较高的IgG和IgA效价。这种自我调节疫苗加速了小鼠肺中PA的清除，同时刺激宿主IL-17a的表达，在人类保护性免疫反应中也可能存在重要意义。虽然暂未有上市的疫苗，但这仍是支扩合并PA感染治疗探索过程中创造性的一步。
4 支扩合并不同细菌感染的免疫机制不同
PA是最常见的引起支扩急性感染的病原菌，此外支扩还可合并其他细菌感染，如肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。研究表明，肺炎克雷伯菌最常见的致病机制为形成生物膜[34]，这一点与PA致病机制相似。但PA与肺炎克雷伯菌之间可相互作用而不受PA群体感应系统Las和Rhl的影响，但最佳生物膜形成需要假单胞菌Ⅳ菌毛，与肺炎克雷伯菌的运动性和产生细胞外基质的能力有关，但在PA存在下，肺炎克雷伯菌的非黏液样变异株生长较差。
流感嗜血杆菌因为其缺乏多糖胶囊的特性可以在75%左右上呼吸道正常的成年人中定植，感染呼吸道上皮细胞，导致宿主免疫反应的调节异常。有研究发现支扩患者在感染流感嗜血杆菌后Th2细胞因子减少表达CD40配体，并产生不同的免疫球蛋白。因此，支扩慢性感染流感嗜血杆菌与其适应性免疫的变化有关。
非结核分枝杆菌是环境中普遍存在的细胞内病原体，经常在土壤和水样中检测到。我国有研究表明[35]支扩是非结核分枝杆菌最常见的易患因素，两者互为因果。最近的一项系统综述表明非结核分枝杆菌可导致支扩可能与以下2种机制有关：一是与慢性肉芽肿性炎症有关。这种炎症会导致气道黏膜溃疡和萎缩。二是涉及慢性炎症性黏液塞的形成，导致气道阻塞和扩张。与PA相同的是感染后气道细胞释放炎症细胞因子及趋化因子，引起夸大的炎症反应，招募中性粒细胞释放弹性蛋白酶和金属蛋白酶，使气道损伤持续存在。
除革兰氏阴性杆菌外，支扩还可合并革兰氏阳性菌感染，如金黄色葡萄球菌等。金黄色葡萄球菌在支扩感染比例可占5%~15%[36]，其可以无症状地定植于人类鼻孔，约有30%的个体永久定植[37]。与PA类似的是，它在转化为慢性感染期间调节毒力因子的同时也可形成生物膜。在缺氧条件下，金黄色葡萄球菌可在肺通气不良的区域形成多糖细胞间黏附素，保护细胞免受中性粒细胞吞噬。
PA形成的生物膜保护细菌免受宿主免疫系统的侵害，并增加对抗生素的耐药性，促使PA更加牢固地定植于病变部位，这与其他革兰氏阴性杆菌机制相似。中性粒细胞可能会通过促进更具耐药性菌株的选择而无意中促进生物膜的稳定性。生物膜形成的启动取决于群体感应过程。一旦达到细菌的临界质量，群体感应分子诱导促进生物膜的基因表达。PA的超变性质使其能够通过表达或灭活基因在肺中存活，这些基因可提高其对环境、免疫和抗生素变化的适应性。
综上，支扩不论合并革兰氏阴性菌亦或革兰氏阳性菌感染，其免疫机制中的共同点均是产生生物膜以保护细菌逃避中性粒细胞等免疫细胞的清除，每种菌均有其独特的作用于支扩机体的机制，其中PA以其独特的超变性质通过表达或灭活基因产生对环境、免疫等一系列的适应性，更稳定地存在于支扩机体中。
5 总结与展望
支扩急性加重时中性粒细胞、淋巴细胞、细胞因子IL-8等水平升高，致使机体免疫功能紊乱；而免疫功能低下的支扩患者更易感染PA，引起Th17/Treg、Th1/Th17失调以及IL-17a升高，造成支扩患者免疫功能紊乱进一步加重；支扩与PA二者之间相互作用，增加了支扩合并PA感染患者的治疗难度，因此国内外学者针对PA易耐药性与免疫调控靶点进行相关疫苗的研究，取得了创新性进展，为精准评估支扩病情、挖掘免疫调节和靶向治疗药物提供理论依据。
引用: 李艳, 庞博, 葛紫贺, 等. 支气管扩张症合并铜绿假单胞菌感染免疫机制研究进展 [J] . 国际呼吸杂志, 2023, 43(10) : 1219-1223.
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