支气管扩张症病原感染特点与精准诊断及抗感染治疗
支气管扩张症病原感染特点与精准诊断及抗感染治疗
支气管扩张症是一类由各种病因引起支气管持久扩张的气道疾病的总称，具有独特的个体异质性，其实质为反复发生的化脓性炎症，致使中小支气管管壁各层结构不可逆受损，出现永久的病理性扩张。支扩在不同发展水平国家的患病率逐年增长，自2004-2013年英国男女患病率分别由301.2/10万、350.5/10万上升至485.5/10万、566.1/10万［1］，在德国从2009-2017年由52.5/10万增长为94.8/10万［2］，而我国仅2013-2017年就从75.48/10万飙升至174.45/10万［3］。患者以慢性湿性咳嗽为主要表现，局部气道始终存在“纤毛清除障碍-感染和炎症-结构性肺损伤”这样错综复杂的循环［4］，其中感染、炎症是促使病情发展乃至肺部结构发生改变的最主要因素，因此识别感染、精准治疗是现有缓解症状、改善预后的关键措施，现以此阐述相关研究成果。
一、支扩病原体感染特点
大量微生物基因的分类测序，揭示了支扩患者下呼吸道复杂的微生物群落，其肺部微生态相对稳定且高度个体化，微生物多样性的破坏以及部分优势致病菌属的建立目前认为是促使病情长期进展的主要因素［5］。其通过促进气道损伤、诱导支气管和全身炎症以及逃避宿主免疫反应等三大机制共同致病［6］。这些致病菌主要涵盖铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）、流感嗜血杆菌（hemophilus influenzae，HI）、卡他莫拉菌（moraxella catarrhalis，MC）、肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，KP）等变形杆菌门革兰阴性菌，以及肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，SP）、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）等厚壁菌门革兰阳性菌［7］，并且近年来得益于分子生物技术的发展，分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉属等传统方法难以检测的特殊病原体的检出率也有了显著提高。
1. PA：
PA是一种广泛存在于水生生境中的γ-蛋白细菌，几十年来从传统培养法到目前的基因测序技术都验证了PA和HI在急慢性支扩患者气道微生物组学中的核心地位。在病原学结果阳性且有临床意义的住院支扩患者中，49.2%检出了PA［8］，而10年前这一比例为70.6%［9］。急性感染时PA诱发强烈的、与菌量负荷平行的中性粒细胞炎症反应，免疫抑制时可引起严重的机会性感染，患者痰液性状明显恶化、肺功能显著下降，病死率增加近3倍［10］；长期应用质子泵抑制剂是PA反复感染的高危因素［11］，估测12%~27%的稳定支扩存在慢性定植［12］。在此过程PA依靠中性粒细胞胞外陷阱破坏竞争菌群成为优势菌，又通过降解中性粒细胞胞外陷阱破坏宿主防御；利用群体感知系统调控毒力因子相关的基因表达，促进生物被膜的形成并提高抗菌药物耐药；还可诱导气道上皮酸性神经酰胺酶表达下调以此减轻鞘氨醇对自身的杀伤［13］；以及通过mucA基因截短突变向黏液型转化以长期逃避免疫清除［14］，这些机制共同促进PA的长久生存。PA通过固有耐药、获得性耐药和适应性耐药产生抗药性，在西班牙地区支扩患者的PA平均耐药率达到15%，对环丙沙星（44.19%与38.4%）、亚胺培南（32.6%与15.6%）、妥布霉素（18.6%与16.3%）及阿米卡星（18.6%与4%）的耐药率较全国总体呈上升趋势，后者检测标本并非完全来自支扩患者，因而有一定误差［15, 16］；而近5年我国下呼吸道PA对亚胺培南和美罗培南的耐药率波动在18.9%~30.7%，对β内酰胺类/β内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类及氟喹诺酮类等其他常用抗生素耐药率均<20%，且呈平稳下降趋势［17］，表明各地间差异较大。
2.非PA：
微生物HI是除PA外参与下呼吸道微生态失调最具优势的微生物，与PA明显拮抗，二者很少从标本中同时分离。最近欧洲的多中心队列中［18］，分离率最高的依次为PA、HI和肠杆菌科细菌（enterobacteriaceae，EB），其中PA在绝大多数南欧国家超过50%，HI更多见于英国、北欧和西欧，而EB则在南欧、东欧和中欧分布更广，并且各地区肺功能差异很大，提示地理因素、治疗差异也参与构成异质性。一项队列的结果中KP更多见于伴有慢性阻塞性肺疾病的中年男性，EB整体相较PA与病死率的相关性更为显著，另有研究也发现嗜麦芽窄食单胞菌（stenotrophomonas maltophilia，SMA）感染者在恶化频率、住院率等具有近似PA的不良预后［19］，García Clemente同样在SA患者中观察到肺功能和预后较差，其发病年龄、BMI及基线肺功能相对病原阴性组更低［20］。这些队列结果显示微生物组对病情的长期影响并不亚于PA，各类病原体的感染都要引起足够重视。此外，支扩中仅50%的急性恶化事件与细菌相关［7］，近1/3的急性期标本同时分离出病毒［21, 22］，表明混合感染在支扩发生发展过程中并不少见，并且各类呼吸道病毒的定植和感染也会对病情加重产生影响，这些患者全身炎性反应程度重且住院率高［21, 22］。
3.真菌：
真菌在支扩中的致病作用主要与免疫失调和暴露后的急性过敏反应有关，以白色念珠菌（30%~45%）和烟曲霉（7%~24%）最多见，后者主要表现为Th2驱动的变态反应性支气管肺曲霉菌病（10%）。尽管定植率因地理分布、培养方法和支扩病因不同，但二者均多见于病程迁延并长期应用抗生素的人群，烟曲霉感染的高危因素还包括高龄、严重肺病、痰脓增多等［23］。真菌微生物组在支扩慢性感染中的作用以及与微生物群落中其他成分的交互作用仍需更多探索。
4.特殊病原体：
结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌及诺卡菌是支扩中最典型的特殊病原体，三者均是具有不同抗酸性的分支状革兰染色阳性菌，其既是支扩的病因，也是促使病情进展的高危因素，但临床诊疗差异极大。在诺卡菌感染的支扩患者中，发现其侵袭机制、人群分布、临床表现及影像学特点与非结核分枝杆菌感染相关的温夫人综合征极为相似，由此Zeng等［24］提出了类温夫人综合征的新概念，防止这三类患者误诊误治。
二、病原体的精准检测
各级医院普遍采取深部痰液、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等下呼吸道标本进行传统微生物检测（conventional microbiological test，CMT），包括染色镜检、培养基分离培养和药敏试验，以明确病原体并指导抗菌治疗，此外还涉及血清抗原抗体测定和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等非培养法，多用于非典型病原体、真菌和病毒的检测。传统培养技术存在培养难度大、周期长、对培养基及对标本运送时效性的要求较高等各类缺陷，PCR也具有无法检测未知序列、靶基因污染造成假阳性率偏高等多种局限，同时痰标本也易受口咽定植菌的污染，这些都可能带来不同程度的错检和漏检。既往研究统计入院送检的4 015份痰标本，合格率仅有18.5%，最终能明确病原的患者也仅约12.7%［25］；即使联合微生物培养、PCR和血清学检测共同筛查呼吸道病原体，最终阳性率约为60％，仍有将近40％的感染病原学不明［26］。自1977年Sanger首次应用双脱氧链终止法直接测定ΦX174噬菌体的脱氧核苷酸序列，标志着病原体检测进入基因组学时代。目前临床常用的二代基因测序技术又称为下一代基因测序技术（NGS）、高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS），该技术不依赖于临床假设，无需特殊探针设计，采用平行测序的方式实现了从百万到数十亿条核酸短序列的同时深度测序［27］。基于NGS的测序方法主要包括16S rRNA测序、靶向下一代测序（tNGS）、宏基因组二代基因测序（mNGS）以及宏转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学领域的应用。
1. 16s rRNA测序：
16s rRNA基因普遍存在于原核细胞，该序列占细菌总RNA的比例超过80%，其中囊括V1-V9共9个高度可变区，常利用这些可变区序列在不同种群间的多样性来精准鉴定细菌的特定属或者种。有研究利用该测序发现PA、EB和SMA的富集会显著加重感染及支气管变形，微生物组多样性的下降诱导病情恶化和肺功能持续减低［7］，而长期预防性使用抗生素却能在避免耐药、维持正常群落稳态的同时显著降低PA丰度［28］。另外，PA介导的肠道拟杆菌和酵母菌的促繁殖作用以及三者共同驱动的“肠-肺轴失调”可造成支扩恶化，这种“菌群交互”在小鼠模型中经碳青霉烯类抗生素干预消除［29］。在嗜酸性粒细胞支扩中，应用16s rRNA检测外周血嗜酸性粒细胞计数与痰微生物组之间的联系，观察到≥300 cells/μL及<100 cells/μL分别见于链球菌、假单胞菌及嗜血杆菌为主的集群，该细胞可能参与微生态的不利调节，致使在感染控制且维持较高计数时表现为下一次病情恶化时间缩短［30］。这些结果表明微生物组学可识别不良预后的患者亚组，长期应用抗菌药物能改善预后并减少细菌耐药，并可将肠道微生物群作为潜在靶点实现“肠-肺轴”的有效调控，还可通过嗜酸性粒细胞参与微生物群的调节，反复加重的支扩患者未来可能从这些精准治疗策略中获益。但是，16S rRNA基因仅为细菌和古菌的共有序列，无法通过检测病毒甚至真菌等实现对病原的全面检测，并且在鉴定相关性较高的物种时，该测序对自身可变区基因扩增所需结合的引物类型和引物数量要求也较高，这在一定程度上限制了临床应用。
2. tNGS测序：
tNGS基于超多重靶向扩增/探针捕获，并结合高通量测序技术，对病原体和耐药基因目标区域靶向富集，兼顾DNA+RNA双流程检测，极大缩短了检测时间，此外tNGS可以排除人源核酸干扰，提高检测敏感性。不同于mNGS广覆盖、无偏倚的特点，tNGS对临床常见95%以上低浓度病原微生物超多重PCR扩增，所需数据量更小，提高检测精度高的同时降低了测序成本，实现了成本及性能的双重优化，适用于住院患者的感染初筛。需指出，血液、脑脊液等以游离核酸为主的样本经tNGS检测存在假阴性的问题，该技术自身对于镰刀菌、耳念珠菌等部分真菌、寄生虫以及各类罕见病原体未能覆盖，无法满足混合感染患者鉴别诊断的需求，临床和科研方面均无法替代mNGS，后者对于罕见、未知病原的诊断、溯源和鉴定仍具备决定性优势。
3. mNGS测序：
mNGS利用高通量的二代测序对送检标本中包括细菌、真菌、病毒、寄生虫、非典型病原体在内的全部病原微生物实现快速、准确、全面无偏倚检测，为急性和危重患者迅速提供精准治疗，临床应用更为普遍。BALF、肺组织、胸腔积液、咽拭子、血液、脓液等多种样本经mNGS检测阳性率均高于常规病原学，在双测序平台中的检测效能也显著高于16s rRNA测序［31］。另有研究表明BALF内人源性核酸含量相较痰液和血液更低，对测序结果的灵敏度及特异度干扰更小，是下呼吸道深部感染的最佳检测标本［32］，并且经气管镜提取BALF还可帮助患者气道廓清，缓解症状。最近的荟萃分析显示mNGS对BALF的总检测灵敏度为78%，特异度为77%，在严重感染或免疫低下感染者中的阳性检出率高达92%，展现出不俗的诊断能力［33］；对于结核分枝杆菌、非典型病原体、病毒和真菌等特殊病原体，mNGS也显著优于常规培养，并且游离DNA对于低载量真菌、病毒和胞内感染微生物的检测具有明显优势［34］。但是，mNGS阴性结果仅有助于排除感染，即使危重症患者也可能漏诊，无偏倚检测也带来了致病菌、定植菌、工程背景菌之间鉴别的挑战，需结合中华医学会指南帮助解读［35］。此外，厚壁菌和胞内寄生菌等特殊病原体测序时核酸提取困难，常导致回报序列数极低，一旦检出即应高度警惕，积极寻找高危因素、CMT结果甚至利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术等其他分子生物检查交叉验证，避免漏诊［35］。
传统mNGS受限于宿主高人源核酸背景干扰，导致样本检测灵敏度受限；还因共检灵敏度不足需要预判病原体类型，必须分开DNA和RNA两个检测流程，带来低载量病原漏检、耐药毒力假阴性和患者经济负担较高的问题。最新改良的测序技术兼顾mNGS广谱检测和tNGS靶向检测的特点，在核酸提取后运用并库技术实现DNA、RNA病原同步共检，并加入探针捕获、富集病原序列，为支扩下呼吸感染及微生态等疑难问题提供了一种更全面、高敏、深入的筛查手段，临床应用前景广阔。由此，NGS已成为感染性疾病精准检测与治疗的关键驱动因素，有助于实现患者的个体化诊疗。而最新的三代测序是以单分子测序技术为基础的新一代测序方式，主要包括单分子荧光测序和纳米孔测序，其不需要PCR扩增，并已逐渐控制成本，但距离临床应用还需在病原检测精度上进行更多的临床实践。
三、抗感染应用进展
感染既是支扩最常见的病因，也是促使病情进展和影响预后的最主要因素，因此降低病死率、改善预后的关键仍在于抗感染药物的合理应用。
1.抗生素：
大环内酯类药物主要通过抗菌活性、抑制炎症因子释放、降低气道高分泌和促进组织愈合来发挥抗菌、抗炎和免疫调节作用。阿奇霉素及红霉素的长期低剂量临床试验显著降低了恶化频率，由于随访终点时间不长至今尚未确定最佳给药上限，且红霉素还有增加PA耐药的潜在风险［36］。目前指南［37, 38］推荐每年有3次及以上恶化的非PA患者长期使用大环内酯类抗生素；PA定植患者建议直接使用吸入抗生素，大环内酯类药物作为不耐受或频繁恶化时的二线治疗，用药期间需警惕QT间期延长、胃肠道症状及耐药性非结核分枝杆菌肺病等不良事件。
2.抗炎药：
支扩具有多种炎症形式，以中性粒细胞炎症最多见，也是目前抗炎的主要靶点。其活化时脱颗粒、形成中性粒细胞胞外陷阱释放的中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）破坏上皮纤毛并维持黏液高分泌，导致持续的脓痰和不可逆扩张。Brensocatib是一种口服的NE抑制剂，相关的Ⅱ期试验中［39］，用药24周后10 mg及25 mg干预组均观察到显著下降的痰NE，患者首次恶化时间延长伴发病风险降低，但突出的牙周和皮肤不良事件需在后续纳入1 620名受试者的大型试验中特别关注（NCT04594369）。磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4抑制剂通过改善气道纤毛功能并降低胞内氯离子浓度，已批准用于伴支气管炎表型的重症慢性阻塞性肺疾病患者的维持治疗，但未获得稳定期支扩患者临床疗效的确切证据［40］，另一项评价其对这类患者气道中性粒细胞炎症疗效的试验（NCT04322929）仍在进行。在抗IL-5和抗IL-5Rα抗体治疗嗜酸性粒细胞亚型支扩24周后，患者症状明显改善，所有长期口服激素者实现减停［41］，甚至在嗜酸性粒细胞、哮喘以及支扩共存的患者中也观察到类似疗效［42］，展示了单抗在混合型支扩中的治疗潜力。
3.吸入性抗生素：
通过吸入途径给予抗生素可直接作用局部气道，减轻肝肾负担，促进病菌清除，对于慢性稳定型感染者可降低细菌负荷、改善痰液性质、延缓首次加重时间并减少住院风险［43］，同时提高痰中PA在病程内各个时期的清除率［44］。英国胸科协会将多黏菌素推荐长期用于每年至少3次急性恶化的PA定植者，并推荐庆大霉素作为多黏菌素的替代治疗，以及非PA患者不耐受口服大环内酯类药物的二线治疗［38］。妥布霉素也是支扩中广泛应用的吸入性抗生素，在PA相关的研究中，其与多黏菌素都具备良好的安全有效性以及相似的终点疗效［45］。Ailiyaer等［46］的研究集中于阿米卡星短期雾化对于PA急性感染的疗效，受试者耐受度高，干预组的清除率达到51.4%，而对照组仅23.2%，但没有其他临床获益；其脂质体吸入悬浮液推荐用于难治性鸟分枝杆菌复合体的感染，但Ⅱ、Ⅲ期试验中近50%的药物相关不良事件［47］，使其安全问题在后续的试验中需引起重视（NCT00775138）。其他吸入性抗生素［43，48, 49］，氨曲南适用于基线时细菌负载较高（≥107 cfu/g）、以咳嗽和痰液恶化为主的人群，用药后咳嗽及痰液性状改善近1/4，但对轻中度支扩和其他症状疗效有限；头孢他啶除抗PA外，在85.7%的非PA患者中实现病菌清除，超过50%的患者圣乔治呼吸问卷随着治疗而下降，但呼吸困难没有明显好转；环丙沙星抗PA活性最强，相比氨基糖苷类、氨曲南及黏菌素更能有效降低痰液细菌载量，但未能降低全因病死率。
目前主流的给药装置为小容量雾化器和干粉吸入器，最近的荟萃分析［50］证实二者良好的安全性和临床疗效，但经干粉吸入器有助于延缓患者首次恶化时间并且生活质量提高更显著，该装置还具备给药时间短、药量损失小、运输成本低等多种优势。环丙沙星干粉的两期随机对照研究也展示了可观的安全性，治疗方案为48周的14/28天间断给药，但仅Ⅰ期14 d方案的患者临床获益［43］，这两种方案在Cochrane数据库［51］对比差异并无统计学意义，还都加速耐药，尚无法解释这种矛盾结果，也缺乏连续/间歇给药方案在有效性和安全性的评估。药物不良反应包括头痛、咳嗽、咯血、恶心、发音困难、嗅味觉异常等［43, 44］，并有给药后原喘息、气促恶化的报道［48］，可能为药物刺激上皮诱导支气管痉挛所致。这些副作用是治疗中断的主要原因。迄今吸入抗生素未证明对肺功能有改善作用［43, 44，48］，甚至用药后FEV1下降［44, 45］。
四、总结与展望
分子生物技术揭示了健康个体和慢性肺病患者下呼吸道复杂的微生物群落，部分优势菌属参与微生态失衡，带来的感染和炎症是推动支扩恶性漩涡最关键的环节，其中PA和HI是破坏稳态的核心菌群，二者在群落中相互拮抗，又都可带来更重的病情和更差的生活质量。其他细菌、真菌、病毒及特殊病原体等多种微生物也具有各自感染特点，病程中不容忽视。应用基因测序精准检测病原，探索菌群交互、各类潜在靶点甚至新的生物途径，并制定个性化的精准抗炎、抗菌及免疫调节策略，是目前深入探究的新方向，也是未来解决这种异质性的关键，有望实现病情的长期稳定控制并改善预后。
引用：曾璞, 张明强, 武华旭, 等. 支气管扩张症病原感染特点与精准诊断及抗感染治疗进展[J]. 中国综合临床, 2023, 39(6): 429-435.
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